通用菌落PCR检测试剂盒
Cat. #：P8011，P8012
产品简介
本试剂盒利用PCR原理，结合本公司的快速DNA聚合酶（延伸速率20s/kb），设计适用性广的最佳引物，优化PCR反应缓冲体系，同时简化检测方法，可用于各种常用T载体克隆的筛选检测。
产品组成
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Component |
P8011 |
P8012 |
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2× FSTM Mix |
500 μl |
1 ml × 5 |
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T-primer (10 μM) |
50 μl |
500 μl |
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超纯水 |
1 ml |
1 ml × 10 |
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说明书 |
1份 |
1份 |
活性定义
一个活性单位（U）指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在72℃、30 min内，摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。
保存条件
-20℃保存。
质量控制
纯度检测：经质量检测，产品不含脱氧核糖核酸内切酶、脱氧核糖核酸外切酶和核糖核酸酶污染。
功能检测：PCR方法检测本试剂盒无宿主残余DNA，也无其他DNA污染，能有效完成PCR扩增。
应用举例
1. 准备样品
将过夜培养的平板上的菌落编号后，用灭菌的牙签挑取单克隆菌体的一部分至反应体系中；或在1.5 ml EP管中分装500 μl含有相应抗生素的LB培养基，并做好标记，用无菌牙签提取单个菌落至上述培养基中，37振荡（250-300rpm）培养4h，取1-2 μl菌液用于扩增。
2. 配制反应体系
请于冰上配置反应体系，体系大小与组分用量与添加顺序可调整：
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Ordinal |
Component |
Volume (20 μl reaction volume) |
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1 |
2× FSTM Mix |
10 μl |
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2 |
T-primer (10 μM)* |
1 μl |
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3 |
菌体或菌液 |
1 μl |
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4 |
超纯水 |
To 20 μl |
*包含了上下游引物，扩增大小约为：克隆片段+250 bp。
● 加入各组分后，请用枪头反复吸吹几次，充分混匀。
● 在一次配制多管需分装时建议按（n+1）的反应液量配制，以确保分配时的耗损不会影响实验，同时选择大于总体积的离心管便于混匀。
● 如需使用其他体积的PCR反应体系，请按各组分比例缩减或增加各组分用量。
● 将混匀的各管短暂离心，置于PCR仪中。
3. 设定反应程序进行PCR反应
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Stage |
Temperature |
Time |
Number of Cycles |
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Initial Denaturation |
94℃ |
3 min |
1 |
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Denaturation |
94℃ |
30 sec |
30 |
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Annealing |
55℃ |
30 sec |
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Extension |
72℃ |
30 sec or 45 sec |
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Final Extension |
72℃ |
5 min |
1 |
● 设定PCR程序时，请根据目的片段大小决定延伸时间，如果目的片段大小为500 bp时，延伸时间为15 sec；500 bp-1 kb，延伸时间20 sec；目的片段>1 kb时，延伸时间按20s/kb计算。
3. 分析结果
反应结束后取2-5 μl反应产物与loading buffer混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，通过凝胶成像设备观察目的条带的扩增情况。
注意事项
请严格按照说明书提供的实验体系及实验条件进行试验。
室温下DNA聚合酶有一定的活性，为避免发生非特异性扩增，请于冰上配置反应体系，并且最后添加FSTM Mix或模板DNA。
挑取菌落时，应选择单菌落，不要挑取太多菌体，以免影响PCR结果。
部分适用T载体参考下表：
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公司 |
T载体 |
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Promega |
pGEM-T Vector |
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pGEM-T Easy Vector |
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Takara |
pMD18-T Vector |
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pMD19-T Vector |
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pMD20-T Vector |
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pMD18-T Simple Vector |
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pMD19-T Simple Vector |
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pSIMPLE-18 EcoR V/BAP Vector |
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pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector |
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Tiangen |
pGM-T载体 |
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pBS-T载体 |